ונחלקו הראשונים האם חיוב הבדלה במוצאי יום טוב הוא מן התורה או מדרבנן. הר"ש משאנץ (מובא באגרות הרמ"ה סי' עח) כתב, שהבדלה במוצאי יום טוב מדאורייתא, כיון שלדעתו המקור לחיוב הבדלה במוצאי שבת הוא ממה שלמדו בשבועות (יח:) שכל המבדיל על היין במוצאי שבתות יהיו לו בנים זכרים, מכך שכתוב (ויקרא י י) ולהבדיל בין הקודש ובין החול', וכן יש ללמוד מכך שיש חובה להבדיל בין השבת לימות החול. וכיון שפסוק זה לא נאמר רק על שבת אלא כתוב בו סתם בין הקודש ובין החול', יש ללמוד ממנו חובת הבדלה גם במוצאי יום טוב. וכן כתב הריטב"א (ביצה ד: ד"ה רב) שהבדלה במוצאי יום טוב מדאורייתא.
הרמב"ם (שבת פכ"ט הי"ח) פסק, שמקדשים ומבדילים בימים טובים כמו בשבתות, וכתב המגיד משנה שקידוש של יום טוב אינו מדאורייתא, וכתב הקובץ שעורים (ביצה ד: אות יא) שכוונת המגיד משנה היא, שכיון שלדעת הרמב"ם לומדים את חובת קידוש והבדלה בשבת מהפסוק (שמות כ ח) "זכור את יום השבת לקדשו', אין מקור לקידוש והבדלה ביום טוב, שהרי רק שבת נזכרה בפסוק ולא יום טוב. ואין ללמוד את יום טוב משבת,כיון שהכלל הוא שלא לומדים מהחמור לקל כדי להחמיר עליו מד, וכיון ששבת היא החמורה לא לומדים ממנה ליום טוב הקל כדי להחמיר עליו להצריכו הבדלה. ובהכרח שהבדלה במוצאי יום טוב מדרבנן, וכן הדין לפי כל הראשונים הסוברים שהבדלה נלמדת מפסוק זה מה.
והקשה העמק ברכה (קידוש והבדלה אות ד) לדעת הסוברים שהבדלה במוצאי יום טוב מן התורה, מדוע לא מבדילים במוצאי יום טוב שחל להיות בערב שבת, וכיצד התבטלה מצות עשה מן התורה ביום טוב שחל להיות בערב שבת. ותירץ, שיתכן שהיתה קבלה בידי חכמים שאין להבדיל אלא בלשון "הבדלה', או שלמדו מהפסוק "ולהבדיל' שנוסח ההבדלה חייב להיות באופן שיכלול את משמעות ההבדלה בין קודש לחול, וכיון שבמוצאי יום טוב החל בערב שבת, אי אפשר לומר לשון הבדלה, משום שבו יוצאת קדושה קלה ונכנסת קדושה חמורה, ממילא בטלה מצות הבדלה ביום טוב שחל להיות בערב שבת, גם לדעת הסוברים שהבדלה במוצאי יום טוב מן התורה.
